倒置荧光显微镜搭配荧光蛋白能可视化观察活细胞的细胞器，而想达到更精细的特定目标细胞或特定部分进行标记示踪，则需要用到光激活、光转化或光控开关荧光蛋白，一般这需要共聚焦显微镜或者超分辨显微镜，但也有方法可以用普通的倒置荧光显微镜（宽场荧光）观察，今天我们就来跟大家介绍一下。
光转化荧光蛋白mEos2转化观察
·光转化荧光蛋白
光转化荧光蛋白Kaede有两个激发峰，两个发射峰
光转化荧光蛋白是超分辨成像常用的染料，以Kaede为例，在激发光照射下，会发出绿色荧光，而用紫外照射后，会不可逆地转化为红色荧光。这种特性可以让研究人员界定特定的细胞，或细胞的特定部分，作为ROI。
光转化荧光蛋白多来自珊瑚
这种绿红转化的荧光蛋白来自珊瑚，因其转化跟秋天的枫叶从绿变红相似，故而得名Kaede（枫叶），但由于性质限制，Kaede并不是可靠易用的商用活细胞染色剂。在超分辨成像中常用的光转化荧光蛋白主要有Dendra2、mEos2、和mKikGR三种。
Dendra2荧光光谱更符合常规激发块设计
·为什么用宽场荧光显微镜？
研究级倒置荧光显微镜MF53-N（宽场荧光）
一般的荧光显微镜都是宽场荧光显微镜，相比共聚焦显微镜，它的Z轴分辨率没有那么高，高倍放大下成像会有焦外激发形成的光晕，无法获得边缘非常锐利的荧光成像。
但荧光显微镜观察光转化荧光蛋白有几个好处，首先荧光显微镜的仪器成本要比共聚焦低得多，而且相对简便易用，是相对更普及的仪器设备。
长通U激发下的蕨叶，可见多色荧光
此外，共聚焦显微镜为了追求精度，通常无法在操作光转化的同时观察转化情况。而荧光显微镜的U紫外激发块配置，很多用的是LP长通发射滤光片，可以同时显示蓝色发射到红色发射，可以在操作光转化同时观察转化情况。
·荧光显微镜如何观察光转化荧光蛋白
研究级荧光显微镜MF43-N
荧光显微镜想要观察光转化荧光蛋白，先决条件是有多色激发块配置，并且荧光光路有视场光阑，用长通配置的U激发块（DAPI激发块），这可能需要研究级的荧光显微镜。
Connexin43-Dendra2揭示缝隙连接蛋白Cx动态
转化前的成像和准备：
1、关灯准备暗室成像，让眼睛适应暗室。
2、切换激发块到蓝色激发波长。
3、LED荧光光源把亮度调低，然后关掉；汞灯光源请插入ND滤光镜。关闭激发光挡板（如有）。
4、转换为100X油浸物镜或其他高倍物镜，油镜加油。
5、放置准备好的样品。
6、使用相衬观察，对焦到细胞上，把转化目标移到视野中间。
7、LED荧光光源打开激发光；汞灯光源打开激发光挡板（如有）；
8、调节到合适参数，拍照，获得转化处理前绿色荧光图像。
9、切换激发块到绿色激发波长，调节参数拍摄红色荧光图像。通常没有或少量红色荧光。
Dendra2-H2B揭示组蛋白H2B非常稳定
操作观察转化荧光蛋白和成像：
1、相衬观察，确认目标在视野中间。
2、收小荧光光路的视场光阑，以将荧光照射范围缩小到视野中间。
3、切换激发块到紫外波长，调高LED荧光光源亮度，汞灯要拔出ND减光镜。可以在目镜下看到绿色荧光向红色荧光转化，可以调节荧光光路的视场光阑控制转化区域大小，转化时间可能耗时5-10秒，视乎紫外光源的强度。
4、切换到B激发块，打开荧光光路视场光阑，拍摄绿色荧光，切换到G激发块拍摄红色荧光，现在应该可以看到明显的红色荧光。
5、设定时间间隔，拍摄绿色和红色荧光，即可对特定细胞或者蛋白的变化进行研究了。
Dendra2-α-tubulin示踪微管蛋白动态聚合和分离
利用这套工作流，你还可以观察光激活蛋白、FRET荧光共振能量转移、光控开关荧光蛋白，对于一些比较宏观的教学和研究都非常方便。
相关文章阅读推荐：
