显微荧光光谱分析软骨退变

摘 要：采用显微成像荧光光谱系统对退变（病变）的软骨及健康软骨样本不同深度位置进行显微探测和荧光光谱采样。结果显示：在非钙化区，退变样本的３４０／４１４nm 荧光光谱强度低于健康样本，而在钙化区和骨质区，退变样本荧光强度则高于健康样本；２ 类样本在钙化区和骨质区的荧光光谱强度均高于非钙化区。利用显微成像荧光光谱技术研究关节软骨提供了一定的实验依据和病变特征，有助于相关疾病的早期监测及诊断研究。

显微成像荧光光谱技术 利用该技术可以同时获得样品的荧光光谱信息以及显微形貌，有利于同时实现其组织内部成分及外部微观形态的观测。此外，该技术具有检测速度快、信号强度高、对样品要求低、易于标记、活体测量不易受水分影响等优点，因而被广泛运用于多个领域的基础科学研究及应用研究。

生物荧光光谱技术可以检测光和组织的相互作用，并提供有关分子、细胞和组织的生物化学和形态学信息，是生物医学研究和诊断的１ 个重要手段。它的２ 个至关重要的荧光光谱特征参量是荧光强度和波长。前者是在激发光的作用下样品所发射的荧光强度，它与激发光的波长、样品的构成、分子结构、浓度、所处的环境等因素有关，反映相关荧光物质的分子属性及含量。

关节软骨是一类透明软骨，表面平滑，有利于关节的弯曲、润滑、减震和缓冲等，在人和动物的日常运动中发挥着重要的生理功能。软骨主要由软骨基质和软骨细胞组成，软骨基质的主要成分为胶原蛋白和蛋白多糖、以及水和少量无机离子。

关节软骨从软骨外表面至骨质之间可分为非钙化区（含表层区（SZ） 、过渡区（TZ）和深层区（DZ））与钙化区（CZ） ，深层区与钙化区之间有１ 条潮线相隔，钙化区下方为骨质区。在关节软骨的各个分区内，各主成分的含量及结构均有不同。当胶原网络结构发生破坏，PG 出现流失时，即意味着软骨退变甚至骨关节炎的发生。

目前，已有一些科学家针对关节软骨进行了荧光光谱研究。１９９１ 年，Akiyoshi［３ ］ 分析了老化的人关节软骨的荧光特性，指出戊糖的波长为３３５／３８５nm ，嘧啶为２９５／３９５ nm 。２００１ 年，Gibson 等 观察到了３７０／４４０ nm 附近的特征峰，并提出该特征峰代表了糖化胶原的荧光强度。２０１２ 年，Kinnunen 等利用苏阿糖溶液对软骨样本进行培养来模拟软骨退变，并通过荧光分光光度计检测到了糖基化终产物（AGE）的积累，以及戊糖和赖氨酸嘧啶浓度的增加。２０１６ 年，国内研究者对软骨的荧光显微检测方法进行了研究，对荧光强度图像进行了统计处理，发现了健康样本与病变样本的差异，并基于荧光的偏振敏感特性，利用线性二色性方法揭示了软骨组织存在的荧光各向异性特征。但过去的这些研究都没有能够将荧光光谱和显微成像相结合进行软骨（及下骨）病变条件下的主成分含量变化研究。

由于关节软骨的特征构成，其主成分的（自发）荧光特征（强度）也相对比较明显。因此，利用显微成像荧光光谱技术对其进行研究和表征，将会获得非常明显而具说服力的结果，为后续的关节疾病研究和相关应用奠定坚实的基础。

以下为研究者所做的样品实验图

退变样本由表及里依次标记为A 、B 、C 、D 、E 、F 、G 和骨质区；

健康样本由表及里依次标记为A 、B 、C 、D 、E 、F 和骨质区。

图1 退变和健康软骨样本的显微成像

１ — ３ 分别来自健康样本A 、C 、B ；

４ — ６ 分别来自退变样本C 、A 、B ；

７为背景光谱。

图2 软骨的荧光光谱（以５４０nm 谱带为归一化内标）

所有荧光光谱。随着采样位置深度的增加（A → 骨质区） ，荧光强度逐渐增加，尤其是从非钙化区到钙化区。所不同的是，健康样本骨质区的荧光强度分别高于钙化区和软骨区，而退变样本骨质区的荧光强度则低于钙化区荧光强度。

结 论

采用显微成像荧光光谱技术，对健康软骨切片样本与退变软骨切片样本的显微成像和荧光光谱进行了分析，获得了荧光特征强度随深度的变化规律，发现了退变发生时软骨中主成分的变化情况，为软骨退变及骨关节炎的研究打下了基础。

以上文章部分内容引自南京航空航天大学自动化学院尹建华教授相关文献，特此感谢！